試劑配制和準(zhǔn)備
1. DEPC水或RNase free水；
2. 75%乙醇（現(xiàn)配后預(yù)冷）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水：無水乙醇=1：3），然后放4℃?zhèn)溆谩?.5mL DEPC水+4.5mL無水乙醇；
3. 異丙/醇：棕色瓶；
4. lv仿：棕色瓶；
5. Trizol：存放于4℃。
RNA抽提
1. 勻漿：在通風(fēng)櫥中往含有組織塊的EP管中加入TRIzol和磁珠（組織100mg+1ml trizol +2顆研磨珠）。
2. 研磨：設(shè)置研磨時(shí)間和頻率，一般卵巢組織為65HZ，120s；隨后可以繼續(xù)實(shí)驗(yàn)或者凍存在-80℃。
3. 輕柔顛倒混勻10下，室溫孵育5min。
4. 在通風(fēng)櫥中加入lv仿1/5 trizol體積（0.2ml）。
5. 輕柔顛倒混勻15s，室溫孵育2~3min。
6. 4℃下離心，12000g，15min；觀察液體分層：底層—紅色酚-lv仿相；中間層—粉紅色的交界相；上層—無色液相，即RNA層。
7. RNA分離：用移液槍將上清轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（預(yù)估上清的容積，大約500μL，調(diào)好移液槍），加入0.5ml（與樣品上清等量）異丙醇，蓋緊后顛倒混勻后室溫靜置10分鐘。
8. 4℃下離心，12000g，15min；小心棄去上清（倒去管中液體，殘留液體用槍頭在管口吸掉液體），注意底部的乳白色沉淀物即為RNA。
9. 往沉淀中加1ml 75%的乙醇（用DEPC水或RNase free水現(xiàn)配，預(yù)冷），顛倒混勻洗滌RNA沉淀一次。
10. 4℃下離心，12000g，5min。
11. 用移液槍小心棄去上清（倒去管中液體，殘留液體用槍頭在管口吸掉液體），置于超凈臺上吹干10-15min，讓乙醇揮發(fā)。注意：不能太干，肉眼觀察管壁和管底見得到的液體消失后即可，此時(shí)RNA沉淀稍變透明。注意不能讓RNA沉淀干燥。勿開紫外；室溫吹干不可太長，RNA易降解。
12. 在管中加10~20ul DEPC水或RNase free水溶解，37℃水浴鍋溫水浴10min，使RNA溶解。
13. 測濃度評估提取的RNA質(zhì)量：A260/280在1.8-2.0之間；A260/230在2.0左右；A260在0.1-1之間。
14. RNA的保存：提取的RNA保存于-80℃超低溫冰箱中，最好立即反轉(zhuǎn)錄以cDNA形式保存于-20℃冰箱。
400-0918-500
