使用方法
一、儲(chǔ)存液和工作液制備
1）儲(chǔ)存液制備：用Hepe緩沖鹽溶液（50 mM Hepes/KOH pH7.4, 150 mM NaCl）溶解Dispase II凍干粉，配制成10mg/ml的儲(chǔ)存液，用0.22µM濾膜過(guò)濾除菌。本儲(chǔ)存液置于2-8℃，2周穩(wěn)定；根據(jù)單次用量分裝凍存，高達(dá)2個(gè)月穩(wěn)定，避免反復(fù)凍融。
2）工作液制備：使用時(shí)用合適的細(xì)胞培養(yǎng)液將儲(chǔ)存液稀釋到工作液濃度即可，常用工作濃度為0.6-2.4 U/ml。不推薦使用>2.4 U/ml的工作濃度。具體使用濃度請(qǐng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系或參考文獻(xiàn)來(lái)調(diào)整。
二、組織分離
1）用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm小片，之后用無(wú)菌PBS緩沖液清洗組織片幾次；
2）用Dispase II工作液（0.6-2.4 U/ml）浸沒(méi)并37℃孵育進(jìn)行組織解離；
3）置于水平搖床上，低速轉(zhuǎn)動(dòng)，37℃孵育直至組織 完/全 解離；【注意】：第一次使用Dispase II，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定總反應(yīng)時(shí)間。對(duì)于堅(jiān)硬致密組織需要1h的孵育時(shí)間，不過(guò)孵育時(shí)間幾小時(shí)也不會(huì)有副作用。
4）若有需要，將消化產(chǎn)物用無(wú)菌不銹鋼網(wǎng)過(guò)篩，從而分離解散細(xì)胞和殘留組織，或當(dāng)更大片段組織靜置到管底，輕輕倒出上層細(xì)胞。若需要進(jìn)一步解離，則加入新鮮的Dispase II工作液到殘留組織。
5）低速離心收集細(xì)胞，吸掉酶工作液；
6）用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于正常預(yù)優(yōu)化條件下培養(yǎng)。
三、細(xì)胞亞培養(yǎng)
1）用37℃預(yù)熱的Dispase II工作液完/全覆蓋細(xì)胞，置于37℃孵育5min；
2）吸掉溶液，于37℃再孵育10min；
3）顯微鏡觀察以確定消化情況，若有需要，可再孵育15min；
4）用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，低速離心并用培養(yǎng)基清洗細(xì)胞幾次；
5）用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；
6）按照常規(guī)方法進(jìn)行分盤(pán)傳代。
注意事項(xiàng)
1）Dispase是Godo Shusei Co., Ltd.的注冊(cè)商標(biāo)。
2）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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